ENZIMOINMUNOANÁLISIS (ELISA)

ENZIMOINMUNOANÁLISIS

El ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) se basa en la reacción de un Ac o de un Ag acoplado de forma covalente a una enzima, con un Ag o un Ac inmovilizado (fijado sobre un soporte), para detectar finalmente la actividad enzimática con ayuda de sustratos específicos.

Es un método de laboratorio calificado de immuno-enzimático.

Pueden ser de dos tipos:

HOMOGÉNEOS:

Los ensayos homogéneos no requieren lavado o separación física de las sustancias reaccionantes antes de medir la actividad enzimática.

No requiere la separación de las fracciones ligada y libre resultantes de la reacción inmunológica.

Los reactivos necesarios son el anticuerpo y el antígeno marcado con el enzima.

Cuando el antígeno marcado se une al anticuerpo, este impide el acceso del sustrato al centro activo del enzima, por lo que anula su actividad.
A mayor concentración de la molécula problema, menor cantidad de antígeno marcado se unirá al anticuerpo, quedando mayor cantidad de antígeno marcado libre con el enzima activo dando una mayor actividad.

HETEROGÉNEOS:

Los ensayos heterogéneos sí necesitan la separación física de los reaccionantes en las fracciones libre y ligada antes de la determinación de la actividad del enzima marcador.

ELISA´s HETEROGÉNEOS

Requiere la separación de las fracciones ligada y libre resultantes de la reacción inmunológica.

El antígeno de la muestra problema y el marcado compiten por el anticuerpo, de forma que cuanto mayor sea la cantidad de antígeno presente en la muestra problema, mayor cantidad de antígeno marcado con el enzima quedará sin unirse al anticuerpo.

En este caso la actividad del enzima no se anula por la unión antígeno-anticuerpo.
Se separan los complejos antígeno (marcado y no marcado)-anticuerpo, se añade el sustrato del enzima para que se produzca la reacción enzimática y se mide su actividad.

Los diferentes métodos de ELISA son:

MÉTODO DIRECTO

Consta de las siguientes etapas:

• Fijación al soporte insoluble (“tapizado”) de antígenos específicos. Lavado para eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados.

• Adición de anticuerpos marcados (“conjugados”) con una enzima; si los anticuerpos reaccionan con los antígenos, el complejo quedará solubilizado. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.

ELISA´s DIRECTO E INDIRECTO

• Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea.

• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.

MÉTODO INDIRECTO

Consta de las siguientes etapas:

• Fijación al soporte insoluble de antígenos específicos para los anticuerpos objeto de estudio. Lavado para eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados.

• Adición del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarán específicamente con los antígenos fijados al soporte. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.

• Adición de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los anticuerpos específicos añadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los antígenos. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.

• Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea.

• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.

MÉTODO SÁNDWICH “DAS” (Double Antibody Sandwich).
Consta de las siguientes etapas:
• Fijación al soporte insoluble de anticuerpos específicos del agente patógeno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados.
• Adición de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de tal forma que si está presente el agente patógeno de diagnóstico (antígeno), reaccionará específicamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para eliminar los antígenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados.

ELISA´s SÁNDWICH

• Adición de anticuerpos específicos del antígeno a detectar (deben tener un epítopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los antígenos añadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos.
• Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea.
• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.

MÉTODO SÁNDWICH “HADAS”
Consta de las siguientes etapas:

Fijación al soporte insoluble de anticuerpos específicos del agente patógeno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados.
Adición de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de tal forma que si está presente el agente patógeno de diagnóstico (antígeno), reaccionará específicamente con los anticuerpos fijados al soporte.
Adición de anticuerpos específicos del antígeno a detectar (deben tener un epítopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte), los cuales reaccionan con los antígenos añadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos.
Adición de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior.
Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea.
Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.

Pasos generales de un ELISA.

Tapizado del pocillo con el antígeno o anticuerpo.
Adición de la muestra problema con la mezcla de antígenos o anticuerpos.
Unión del antígeno o anticuerpo específico al anticuerpo o antígeno tapizado en el pocillo
Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antígeno o anticuerpo no unido
Adición del anticuerpo secundario marcado con la enzima
Unión del anticuerpo secundario al antígeno o anticuerpo
Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida
Adición del substrato
Unión del substrato a la enzima